综述家族性渗出性玻璃体视网膜病变基因
▲ 家族性渗出性玻璃体视网膜病变（familialexudativevitreoretinopathy,FEVR）是以周边视网膜血管发育异常或不发育为特征的遗传性视网膜血管疾病，由Criswick和Schepens于年首次发现并予以命名[1]。FEVR的病理过程主要为周边部视网膜血管化不完全而致视网膜缺血和缺氧，引起血管渗漏、新生血管形成、玻璃体视网膜牵引、黄斑异位、玻璃体积血、视网膜皱襞或全脱离等不同程度的病理改变，严重影响患者视功能，甚至致盲。FEVR临床表现多样，同一家系不同成员症状也不尽相同，严重受累者往往于婴儿期就表现出重度视力障碍，伴眼球震颤、小眼球、白内障等症状，而轻症患者可仅有轻度视力障碍，或完全无症状，仅眼底检查时发现周边视网膜有典型病变。
FEVR的遗传异质性明显，即相同临床表型可由不同基因突变所致，而相同基因突变也可致多种临床表型。常染色体显性遗传（autosomaldominant,AD）为FEVR主要的遗传方式，外显率几乎达%，常染色体隐性遗传（autosomalrecessive,AR）和X染色体连锁隐性遗传（X-linkedrecessive,XL）FEVR也有报道。已知多种基因突变可致FEVR，如NDP（编码Norrin蛋白，致XL-FEVR及Norrie病）、FZD4[编码卷曲蛋白4（frizzled-4，FZ4），致AD-FEVR]、LRP5（编码LRP5蛋白，致AR-FEVR及AD-FEVR）和TSPAN12（编码四旋蛋白12，致AR-FEVR及AD-FEVR）。这些基因的产物均参与典型Wnt或Norrin通路。
图1典型Wnt/β-cantenin通路FZD4及LRP5基因产物组成受体复合物，与Wnt或Norrin蛋白结合，介导Wnt下游信号转导。LRP5蛋白末端序列与Axin结合，Axin起支架作用并与GSK-3、β-cat组成复合物，促进β-cat的磷酸化并进入细胞核与TCF/LEF作用。BP：β-螺旋；Axin：轴蛋白；GSK：糖原合成激酶；β-cat：β-钙紧张素；TCF/LEF：T细胞因子/淋巴增强因子
1、Wnt通路概况Wnt信号转导通路通过调控目的基因的转录，参与细胞增生、凋亡、分化和恶变等多种过程，其中典型Wnt/β-cantenin通路研究最为透彻。Wnt信号转导通路进化高度保守，若Wnt未与FZD4/LRP5蛋白受体复合物结合，细胞质中β-连锁蛋白（β-catenin）被泛素–蛋白酶体通路降解，目的基因保持抑制状态；反之，若Wnt与受体复合物结合，信号通路被激活，抑制细胞质内β-catenin的降解，β-catenin含量增加并进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子（Tcellfactor/lymphoidenhancerfactor，TCF/LEF）作用，促进目的基因表达。Norrin通路与典型Wnt/β-catenin通路有许多相似之处：Norrin蛋白配体结合FZ4/LRP受体，并需要TSPAN12编码的四旋蛋白参与，促进FZ4多聚化，共同活化β-catenin/TCF转录通路。
Wnt及Norrin通路作用于多种组织，且在眼部血管生长过程中起重要作用。视网膜内Norrin蛋白主要由Müller细胞产生，继而结合血管内皮细胞上FZ4受体，通过调控内皮细胞–壁细胞间的相互作用以控制血管生长。视网膜血管发育迟缓是导致FEVR、Norrie病等以视网膜异常血管化为特征疾病的共同基础。Ye等[2]通过观察fz4CKOPAP/--基因敲除模型鼠，证实Norrin/FZ4/LRP通路在视网膜血管内皮细胞发育中起重要作用。
2、FZD4FZD4基因位于染色体11q4.2，含2个外显子，编码由个氨基酸组成的7次跨膜卷曲蛋白FZ4。与卷曲家族其他成员相似，FZ4细胞膜外侧部分富含半胱氨酸结构域（cysteine-richdomain，CRD），其细胞膜内侧结构域包含T-X-VPDZ连接序列和KTXXXW序列。CRD高度保守，是结合Wnt配体的重要位点，也是致病性突变常发生区域；若CRD结构异常，FZ4无法与配体结合，从而影响Wnt或Norrin通路的活化。目前报道过的H69Y、MV、EK、CG、MK、MT、MV等FZD4错义突变均位于CRD上。
目前报道的FZD4致病性突变多为杂合突变，而RQ纯合突变仅报道有1例[3]。Milhem等[4]研究发现，突变型FZ4有3种细胞内定位模式：内质网型、细胞膜型和混合型。P33S、G36N、MT、MV、CR、CR、CY和GD8种突变FZ4，因蛋白错误折叠，不能通过内质网应急质量控制机制，从而滞留内质网中，继而被内质网分子伴侣识别，通过内质网相关蛋白降解机制被降解。有趣的是，当细胞中共表达野生型FZ4和内质网型突变FZ4，并无发现两者形成二聚体，也无发现野生型FZ4留滞内质网内，而野生型FZ4在细胞膜上正常表达，无显性负效应，说明野生型FZ4的功能不受突变型FZ4的影响，单倍型不足效应可能为突变FZ4致FEVR的主要机制。
Robitaille等[5]观察到，野生型FZ4可激活钙敏感酶Ⅱ（CamKⅡ）和蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC），而CamKⅡ和PKC均为Wnt/Ca2+通路的组成成分，故野生型FZ4可活化Wnt/Ca2+信号通路。一些突变蛋白，如M_del和LSfsX，则无法活化Wnt/Ca2+信号通路，可能与AD-FEVR相关。Qin等[6]和Xu等[7]通过Norrin依赖荧光素酶报告基因检测FZD4突变对Norrin通路活性的影响，结果显示MV、MV、WX和RQ突变FZ4较野生型FZ4活性降低了30%~95%。
FZD4高度保守密码子69位于CRD区。Qin等[6]通过体外实验发现，H69Y突变FZ4与Norrin及Wnt亲和力降低，提示H69Y突变可能为FEVR致病突变。在健康人群中也发现存在H69Y突变，故考虑FZD4存在基因多态性的可能。FEVR患者中H69Y突变的发生率明显高于健康人群，考虑可能H69Y突变本身为致病性突变但外显率较低[7]。少数患者携带双位点突变，可导致患者临床症状加重。如Kondo等[3]报道1例FZD4双位点突变患者（H69Y和GD），其临床症状较GD单位点突变患者严重。Jia等[8]也在2个AD-FEVR家系中发现FEVR患者FZD4基因H69Y和EK双位点错义突变，其父携带H69Y杂合突变，其母携带EK杂合突变，但双亲均无临床症状；另一患病男童同时携带H69Y和WX双突变，其父携带WX单位点突变，荧光素眼底血管造影（fluoresceinfundusangiography,FFA）检查显示双眼存在无血管灌注区，其母亲、爷爷及叔叔携带H69Y突变，母亲双眼有FEVR临床症状；其爷爷及叔叔屈光正常，无临床症状。此外，双基因突变也可致FEVR临床症状加重。Shastry等[9]在1个AD-FEVR家系中发现FZD4（LfsX）和凝血因子V（外显子10上的GA突变）双基因突变，FZD4位于染色体11q，凝血因子V位于染色体1q21-25，两者并不连锁。凝血因子V突变可致周边视网膜新生血管化及中心静脉血栓的形成，FZD4和凝血因子V基因可能协同影响视网膜血管化。
3、LRP5LRP5基因位于染色体11q13上，含23个外显子，编码由个氨基酸组成的单次跨膜蛋白，为低密度脂蛋白受体（lowdensitylipoproteinreceptor，LRP）超家族成员。LRP5蛋白由细胞膜外侧3个YWTD-EGF结构域、4个LDLR配体结合结构域、1个跨膜结构域及细胞膜内侧区域组成。YWTD-EGF结构域由5个YWTDLDL-B级重复序列及1个非LDL-B级重复序列组成β螺旋结构，并连接1个类EGF结构域，2个起始β螺旋为Wnt或Norrin的结合位点。LRP5蛋白细胞膜内侧区域含有1个或多个短信号序列，与受体介导的内吞作用相关。LRP5蛋白C端包含5个PPP（S/T）P序列，该序列通过与轴蛋白（Axin）连接，介导Wnt下游信号转导。在Wnt通路中，Axin起支架作用并与糖原合成激酶-3、β-catenin组成复合物，促进β-cantenin的磷酸化。LRP5蛋白在骨骼、肝脏、心脏、视网膜、皮肤及胰腺等许多组织的各个发育阶段中均高表达，并在糖和脂肪代谢中起重要作用。LRP5蛋白与FZ4协同作用，激活典型Wnt或Norrin通路，诱导目的基因转录。
LRP5在骨骼、眼部血管发育中起重要作用。目前已报道30余种可致FEVR的LRP5突变[10]。r18为功能丢失性基因突变，表现为LRP5外显子23上单核酸插入，造成C-端3个PPP(S/T)P重复序列丢失，使得连接Axin的停泊位点消失，因而抑制下游转录因子的活化及视网膜血管发育相关基因的表达。Xia等[11]观察到lrp5r18纯合突变鼠的视网膜毛细血管网发育不完整，且出现无管腔毛细血管，证实LRP5蛋白在视网膜血管发育过程中起重要作用。LRP5突变致FEVR的患者也常伴有骨密度降低或骨折史[10,12-14]。LRP5不同类型突变可致不同临床表型[14]。发生在LRP5蛋白N-末端YWTD-EGF或LDLR结构域的截断或框移突变常可致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征（osteoporosispseudogliomasyndrome，OPPG），为罕见的AR遗传病，临床表现为骨密度降低和先天性/婴儿期视盲。发生在蛋白C端的截断或框移突变则引起临床症状较轻的FEVR样改变。Chen等[12]在lrp5-/-鼠模型上观察到玻璃体血管残留，视网膜浅层血管发育延迟和视网膜深层血管网缺失，并伴有骨密度降低。lrp5-/-鼠视网膜中Cln5（参与内皮细胞黏附、迁移，血管腔形成）、Slc38a5（参与视网膜内谷氨酸的运输）和Wnt7b（参与巨噬细胞介导的玻璃体血管退化过程）表达下调，Plvap（血管渗透率标志物）表达明显升高（提示血–视网膜屏障损伤）。
Fei等[10]在2个FEVR家系中发现LRP5双位点突变。先证者1携带AT和QP双突变；其父亲携带AT，无临床症状，但FFA显示双眼存在无血管灌注区伴有骨密度降低；其母携带QP突变，无临床症状且无眼底及骨密度改变。相似地，先证者2携带LP和TM双突变，仅其母亲携带LP突变，无临床症状，但眼底有异常和骨密度降低。2例先证患儿有典型FEVR眼底改变和骨密度降低，临床症状较于其父母更为严重。AT和LP突变定位于进化高度保守的第2个β螺旋，而QP和TM突变定位于第3个β螺旋。QP突变LRP5活性并无明显降低，提示QP突变可能为非致病突变。Qin等[13]也曾报道LRP5双突变（FC和TM）FEVR患者。此外，Qin等[6]报道1例LRP5（RC）和FZD4（RQ）联合突变患者。相比于单位点突变，双位点突变或双基因联合突变LRP5功能显著降低。
4、NDPNDP基因位于染色体xp11.4，含3个外显子，仅外显子2、外显子3编码蛋白，外显子1与基因表达调节相关。NDP基因编码由个氨基酸组成的Norrin蛋白，为半胱氨酸结生长因子超家族成员。Norrin蛋白含2个主要结构：六分子半胱氨酸组成的典型半胱氨酸结和位于其氨基酸末端的单股肽链，该信号肽指导Norrin蛋白细胞内定位。Norrin以头尾相接的形式，通过3个二硫键（C93-C95、C95-C93、C-C）组成特殊的半圆形同源二聚体，并参与Norrin通路信号转导。
Norrin对眼、耳、脑部、女性生殖系统内血管发生至关重要，对视网膜神经元有保护作用，且对维持血–脑屏障和血–视网膜屏障的完整性起关键作用。Norrin分别与FZ4受体CRD和LRP5/6受体起始2个β螺旋区域结合，活化β-catenin/TCF转录通路。此外，Norrin通路中FZ4的活化需要TSPAN12蛋白的参与，TSPAN12与FZ4形成异源二聚体，可能起分子伴侣作用以稳定FZ4并增强Norrin通路信号。
现已发现超过种NDP致病性突变。大多数突变可导致Norrie病，仅有小部分突变致XL-FEVR。NDP基因的R41S、Y44X、C96W、LP、RW突变与持续性胚胎血管化（persistentfetalvasculature，PFV）、早产儿视网膜病变（retinopathyofprematurity,ROP）相关，这些疾病存在共同的病理表现：视网膜血管发育迟滞，周边血管异常并受牵引。致FEVR的突变多发生在Norrin蛋白的41-58位残基、-位残基和位残基。据二级结构预测，这些区域参与构成半胱氨酸结（这些区域主要编码半胱氨酸结），可影响Norrin蛋白的折叠以及Norrin与相应受体的结合。
Xu等[7]分析18种与FEVR/ROP相关的NDP突变，除L13R突变影响信号肽功能外，其余突变型均不影响蛋白产量或分泌效率。这些突变中有11种突变降低Norrin/FZ4通路活性，但K58N突变可使Norrin/FZ4通路活性增强。Qin等[6]检测与FEVR和Norrie病相关的NDP错义突变时，同样发现K58N增强Norrin/FZ4通路活性。虽然无任何突变影响Norrin二聚化，但K54N、K58N和RL突变可影响Norrin与其他蛋白的结合能力。
不同的Norrin突变类型可能导致不同的临床表型。删除及截断突变均导致Norrie病，错义突变可致Norrie病或FEVR。Pelcastre等[15]在2个墨西哥Norrie病家系中发现R41T突变，但有研究表明同一个位点的R41K突变可致XL-FEVR[16]，R41S突变可致PFV[17]。临床表型严重程度可能与该位点突变时氨基酸替换类型有关，若突变未影响二硫键，则临床症状相对较轻，但也有可能是因为临床上对该系列疾病的诊断标准不统一，从而导致诊断的偏差。
Kondo等[18]在1个日本XL-FEVR家系中首次发现，NDP杂合突变女性携带者可出现FEVR临床症状。女性受累者于该家系中散在分布，患儿母亲及姐姐均携带K54N突变，且临床症状较男性轻，考虑与X染色体失活有关，但检测结果显示受累女性X染色体并无失活，出现此现象的原因目前尚不清楚。
5、TSPAN12TSPAN12基因位于染色体7q31，含8个外显子。外显子2~8编码蛋白，外显子1为可变性非编码外显子，决定蛋白异构体。TSPAN12具有特征性4次跨膜结构，蛋白的N/C端均位于细胞膜内侧。跨膜结构域与小细胞外环、大细胞外环和小细胞内环3个环状结构相连。大细胞外环上有特征性CCG序列和半胱氨酸残基组成的二硫键，参与蛋白的正确折叠。TSPAN12通过与四旋蛋白或其他蛋白相互作用，促进多分子膜复合物的形成。
Junge等[19]研究发现，tspan12-/-鼠与FEVR模型鼠表型相似，存在视网膜血管发育异常，并进一步证实TSPAN12蛋白为Norrin/LRP5/FZ4通路的重要组成部分，增强该通路信号转导。TSPAN12过度表达能逆转突变Norrin及突变FZ4引起的β-catenin信号降低，这可能与TSPAN12诱导FZ4多聚化有关。
Poulter等[20]于70例FEVR患者中发现7种致病性TSPAN12杂合突变：F73LfsX、LX、L23X、PSfsX、L23GfsX88、LH、MR。在所有突变中，未发现基因型-表型间关联，截断突变和错义突变患者无表型差异，单倍型不足效应是TSPAN12突变蛋白致FEVR可能的机制。
TSPAN12突变可致AD-FEVR及AR-FEVR。Poulter等[20]对一AD-FEVR家系进行TSPAN12基因检测时发现，3例临床症状严重患者中存在纯合突变YC，其余临床症状较轻受累者均为杂合突变。YC定位于LEL结构内（YC编码LEL区域），影响了该结构域的折叠，从而影响TSPAN12蛋白功能。Poulter等[20]继而对10例严重FEVR或视网膜发育不全患者进行检测，发现TSPAN12AR-FEVR突变LP。LP定位于第4穿膜结构内（LP编码第4穿膜结构域），将位赖氨酸替换为脯氨酸，影响该结构域的螺旋结构。该研究还显示FEVR表型与TSPAN12突变程度相关，双等位基因突变的患者临床症状比单点突变患者更加严重。
6、ZNFZNF基因位于染色体11p11.2，含5个外显子，编码由个氨基酸组成的C2H2锌指蛋白，为锌指蛋白转录因子家族成员。锌指蛋白是常见的DNA识别结构，参与细胞的发育和分化过程，根据锌指结构数量和类型，可将其分成不同亚群。C2H2为最常见的锌指结构，存在于2%的人类蛋白结构中。每个锌指结构由锌离子和2个半胱氨酸及2个组氨酸构成，组成一个疏水核心。锌指结构数量越多，蛋白功能越多样，与特异性受体亲和力越高。ZNF蛋白含10个C2H2锌指结构，串联排列，定位于蛋白C端，参与DNA结合作用。ZNF蛋白内含有1个SET结构域，该结构域通过蛋白间相互作用调节染色质介导的基因表达。ZNF广泛表达于组织器官中，尤其在视网膜及胚胎眼中高表达，提示其在眼部发育中有重要作用。
Collin等[21]在1个荷兰AD-FEVR家系中发现ZNF错义突变HY，定位于进化过程中高度保守的第4锌指结构内（编码进化过程中高度保守的第4锌指结构）；继而在1个日本FEVR家系中发现错义突变SN，致病性未知。通过转染COS-1细胞，发现野生型和SN突变型ZNF蛋白均定位在细胞核内，而HY突变型ZNF蛋白定位在细胞质内。通过共转染检测证实，HY突变型能将野生型ZNF蛋白留滞在细胞质内（HY突变型ZNF蛋白留滞在细胞质内）。在ZNF基因敲除斑马鱼胚胎中，发现胚胎视网膜异常血管化，且该现象能被野生型ZNF蛋白逆转，证实ZNF与视网膜血管发育存在相关性，提示ZNF突变可导致FEVR。
7、展望DNA测序近年来被广泛应用于生物医学各研究领域。早期以Sanger测序技术为主流，于年通过此技术完成人类基因组计划；全基因组测序和外显子测序成为新一代的DNA测序技术，该技术以低廉、快捷、高通量为特点迅速发展，这些技术给包括FEVR在内的遗传病诊断和治疗带来多种优势，如快速提供诊断，明确遗传方式，给患者及亲属提供准确的风险评估；协助胚胎植入前遗传学诊断、产前诊断或携带者检测等。
随着DNA测序技术的发展，多种遗传性视网膜病变致病性突变被发现，并促进基因治疗的发展。眼球具有位置浅表、结构封闭和免疫豁免等特点，是基因治疗的理想位点。目前，已有FZD4、LRP5、NDP、TSPAN12、ZNF5种FEVR致病基因被发现，给下一步基因治疗的发展奠定了良好的基础。然而，值得注意的是，这5种基因仅可解释约50%的FEVR病例，随着DNA测序技术的不断完善，更多致病基因和病理机制有待发现及深入理解，以协助诊断并推动FEVR特异性治疗手段的应用和发展。
来源：中华实验眼科杂志
医学空间—医学学术社群平台
四大主版块：MS.TV，医学文献，行业资讯，医友圈
转载请注明：http://www.lojkk.com/wahl/1156.html
