好文推荐复方芦丁片有关物质的HPLC
复方芦丁片有关物质的HPLC法测定及主要有关物质的结构推测
DeterminationofRelatedSubstancesinCompoundRutinTabletsand
StructuralIdentificationofMainRelatedSubstances
张平1,2，陈睿1，包综方1，王彦2，阎超2*
(1.上海市松江食品药品检验所，上海；2.上海交通大学药学院药物分析教研室，上海)
摘要：建立了高效液相色谱法测定复方芦丁片的有关物质。采用HALO5-C18色谱柱，以甲醇∶0.4％磷酸溶液(45∶55)(用三乙胺调节pH值至3.0)为流动相；检测波长nm。在该色谱条件下，芦丁、槲皮素与其他杂质峰均分离完全。槲皮素与芦丁的检测限为0.和0.μg/ml，定量限为0.04与0.05μg/ml。槲皮素与芦丁分别在0.04～12.0μg/ml和0.05～3.0μg/ml范围内线性关系良好。通过LC-MS/MS法推测主要有关物质结构，分别为山萘酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷和槲皮素，并推测了有关物质的可能裂解途径。
关键词：芦丁；维生素C；高效液相色谱；液相色谱-串联质谱；有关物质；结构确证；复方制剂
以下为文章节选
复方芦丁片是由芦丁(1)和维生素C(2)制成的复方制剂，临床用于高血压的辅助治疗[1]。1具有抗血管阻力，可降低脆性和通透性，还具有抗炎、抗菌和抗氧化作用[2—3]。2主要用于防治坏血病，也可增加对感染的抵抗力[1]。
1化学结构不稳定，易水解生成槲皮素(3)，影响其纯度及活性。1原料药标准收载于卫生部药品标准化学药品及制剂第一册[4]，采用薄层色谱法控制3，三氯化铝试液显色后置紫外灯(nm)下检视，不得超过4％，主观因素带入的误差较大。复方芦丁片的质量标准收载于卫生部药品标准化学药品及制剂第一册[4]，没有有关物质检查项。有文献报道了HPLC法测定芦丁片的含量及有关物质[5—7]，但是没有对有关物质测定进行方法学验证与结构鉴定。
LC-MS/MS广泛应用于鉴定杂质结构并分析其来源[8—10]。本研究采用LC-MS/MS技术进行主要有关物质的结构解析，推测可能的裂解途径。参考文献建立了有关物质测定方法[11]，采用HPLC外标法定量测定3，采用自身对照法测定其他有关物质。本法可有效控制产品质量，操作简便、灵敏度高、结果准确。
1仪器与试药
2方法与结果
2.1有关物质的HPLC法测定
2.1.1溶液配制
2.1.2色谱条件
色谱柱HALO5-C18色谱柱(4.6mm×mm，5μm)；流动相甲醇∶0.4％磷酸(45∶55)(用三乙胺调节pH值至3.0)；流速1.0ml/min；检测波长nm；柱温35℃；进样量20μl。
2.1.3有关物质测定方法
精密称取1对照品适量，加50％甲醇溶解并定量稀释，制成50ng/ml的溶液，作为灵敏度测试溶液(S/N10)。精密量取自身对照溶液、3对照品溶液与供试品溶液，分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。典型色谱图见图1。
2.1.4专属性试验
取本品，经酸、碱、高温、氧化、光照和加热破坏后(酸、碱破坏样品须中和)，分别按供试品溶液制备方法处理，进样测定，记录色谱图。结果显示，在酸破坏条件下降解生成3的量显著增加，而在其他破坏条件下降解生成3的量较少，尤其是碱破坏条件下。在各种破坏条件下降解生成的有关物质Ⅰ与Ⅱ的量基本一致。降解产物与主峰均可达到有效分离。
2.1.5线性试验
分别精密称取1、3对照品适量，加50％甲醇溶解并定量稀释，制成0.05、0.5、1.5、2.0、2.5和3.0μg/ml的系列1溶液，以及0.04、0.4、2.0、6.0、9.0
和12.0μg/ml的系列3溶液。分别进样，记录峰面积。以峰面积A为纵坐标，浓度c为横坐标，进行线性回归。1和3的回归方程、检测限(LOD)和定量限
(LOQ)结果见表1。
2.1.6精密度和重复性试验
分别精密吸取自身对照液与3对照品溶液，分别连续进样6次，记录峰面积。测得自身对照液中1、3峰面积的RSD值均为0.2％(n=6)。取本品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，共5份，分别进样测定，记录色谱图。结果3的平均含量为0.7％，RSD为1.8％(n=5)；总杂质含量为5.1％，RSD为1.0％(n=5)。
2.1.7杂质漏检与色谱峰纯度考察
采用二极管阵列检测器(DAD)对样品进行全波长扫描，三维立体图表明，在nm处除1主峰外检出的较大杂质有3个，并有8个小峰，较其他波长检出杂质数多。有关物质Ⅰ、Ⅱ和3峰纯度均大于0.。
2.2LC-MS/MS结构鉴定
2.2.1LC-MS/MS分析条件
色谱柱WatersAcquityUPLC-C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相0.1％甲酸甲醇溶液(A)∶0.1％甲酸水溶液(B)，线性梯度洗脱；柱温30℃；流速0.3ml/min；离子源电喷雾电离源(负离子检测)；毛细管电压2kV，离子源温度℃，去溶剂温度℃，去溶剂气流量L/h，锥孔气流量30L/h，离子扫描范围m/z50～m/z。
2.2.2样品前处理
将强酸破坏下的供试品溶液，经HPLC分离杂质，待1主峰流出后收集杂质混合溶液(有关物质Ⅰ、Ⅱ和3)，进旋转蒸发仪浓缩后用50％甲醇溶解，经0.2μm微孔滤膜过滤，使用LC-MS/MS检测离子碎片。采用全扫描检测模式，根据一级和二级离子信息进行质谱解析，并推测其分子结构，以及可能的裂解途径。
2.2.3杂质结构分析
对1及其有关物质进行离子解析，主要碎片离子信息见表3。
通过对有关物质一级和二级质谱的研究，可以确证母离子m/z的峰是有关物质Ⅰ的[M+H]+峰，子离子m/z是碎片山萘酚峰，据此推测有关物质Ⅰ是山萘酚-3-O-芸香糖苷。母离子m/z的峰是有关物质Ⅱ的[M-H]-峰，子离子m/z峰是碎片异鼠李素峰，推测有关物质Ⅱ结构是异鼠李素-3-O-芸香糖苷。母离子m/z峰即有关物质3。见图2。
2.3有关物质测定结果
取4批供试品溶液，分别进样测定。有关物质测定结果见表4。
3讨论
3.1检测波长的选择
经UV光谱全扫描，1在nm的波长处有最大吸收，且2在nm附近没有吸收，可以排除2的干扰。黄酮类物质及其有关物质在nm附近都有很强的吸收，采用nm作为检测波长可获得良好的理论板数与检测灵敏度。
3.2国内外药典的比较
经查阅，USP40-NF35未收载1标准。BP与EP9.0收载的1原料药标准中有关物质的测定方法相同，均采用HPLC法，使用C8色谱柱，检测波长nm，有关物质以相对保留时间定性，以自身对照加校正因子的方法定量。BP与EP方法有关杂质相对主峰保留时间(RRT)分别为1.1、1.2和2.5，本试验的RRT分别为1.27、1.32和1.96，主峰与有关物质分离效果更好，且更快速地检测到3个主要有关物质峰。经全光谱扫描图可见，3个有关物质在nm波长处均有最大吸收，且均大于nm波长处的吸收，据此本试验选择nm作为检测波长。本试验采用C18色谱柱，较C8色谱柱具有更好的保留特性，适合弱极性物质的分离。BP与EP方法均采用四氢呋喃∶磷酸二氢钠溶液的梯度洗脱作为流动相，因四氢呋喃对人体毒性大，属于人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)规定的二类溶剂[12]，不宜采用。本试验采用甲醇∶磷酸作为流动相，简便安全。文献报道了1有关物质的测定[5]，该试验进行了专属性试验，降解产物与主峰能达到有效分离。但是测得的杂质个数与总量均较少，推测是因两方法所用流动相不同。综上，本法能方便、准确、有效地控制本品的质量，可为本品质量标准的提高和修订提供参考。
作者简介：张平(—)，女，主管药师，硕士研究生，专业方向：药物质量控制研究。
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